科瑞斯藻红蛋白抗体标记方案【烟台科瑞斯】藻红蛋白_别藻蓝蛋白

一、藻红蛋白简介

藻红蛋白是从红藻中分离纯化的，能发出强烈的荧光，具有很好的吸光性能和很高的量子产率， 在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。用常规的标记方法可以很方便地将其与生物素、亲和素和各种单克隆抗体结合起来制成荧光探针，用于荧光显微检测、荧光免疫测定、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、流式细胞荧光测定等抗体荧光标记以及活体成像应用等诊断及生物工程技术。

二、试验材料

藻红蛋白染料 ；PD-10柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25M) ，Cytiva 公司产品，产品目录号 No. 17-0851-01；NAP5 柱(葡聚糖凝胶层析柱 Sephadex G-25 DNA grade)， Cytiva公司产品，产品目录号 No 17-0853-02；琥珀酰亚胺-4-(N- 甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)，Thermo公司，产品目录号 ；N-乙基马来酰胺（NEM），Thermo公司，产品目录号 ；二甲基亚砜（DMSO），Thermo 公司，产品目录号 No. D12345。

三、试验方法

1、藻红蛋白的衍生化

①将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜（DMSO）配制成 10 毫克/毫升的母液，PE与琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯) (SMCC)交联摩尔比1:80，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟，使PE分子上的氨基与琥珀酰胺反应发生衍生化。

②交换缓冲液预先平衡凝胶层析柱，将衍生化的PE过柱，收集蛋白峰。

2、抗体的处理

①二硫苏糖醇（DTT）溶解于蒸馏水中，配制成 1 摩尔/升的二硫苏糖醇（DTT）母液，调整抗体的浓度，使其浓度至少为 4 毫克/毫升。

②每毫升抗体溶液中加入 20 微升的二硫苏糖醇（DTT）母液，室温静置反应 30 分钟，将抗体的二硫键打开形成巯基。

③交换缓冲液预先平衡凝胶柱，将反应液过柱，收集抗体部分。

3、藻红蛋白和抗体的共价交联

①每毫克抗体加入 毫克的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的PE，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟，使马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。

②0 毫克的 N-乙基马来酰胺（NEM）溶解于 毫升的无水二甲基亚砜（DMSO）中制成 N-乙基马来酰胺（NEM）母液（现配现用）。

③每毫克抗体中加入 微升N-乙基马来酰胺（NEM）母液，铝箔封好后于室温旋转反应 60 分钟， 反应后，使抗体上的巯基封闭。

4、交联物的存储

将交联物于存储缓冲液中透析后保存于2-8℃。

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